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La domanda sempre crescente di comunicazioni tramite telefonia mobile ha portato alla continua comparsa di tecnologie wireless (G), che possono avere impatti diversi sui sistemi biologici. Per testare ciò, abbiamo esposto i ratti a un'esposizione a una singola testa a un campo elettromagnetico (EMF) LTE (4G Long-Term Evolution) a 1800 MHz per 2 ore. Abbiamo quindi valutato l'effetto della neuroinfiammazione acuta indotta da lipopolisaccaride sulla copertura spaziale della microglia e sull'attività neuronale elettrofisiologica nella corteccia uditiva primaria (ACx). Il SAR medio in ACx è di 0,5 W/kg. Le registrazioni multi-unità mostrano che l'LTE-EMF innesca una riduzione dell'intensità della risposta ai toni puri e alle vocalizzazioni naturali, mentre un aumento della soglia acustica per le frequenze basse e medie. L'immunoistochimica Iba1 non ha mostrato cambiamenti nell'area coperta dai corpi e dai processi microgliali. Nei ratti sani, la stessa esposizione a LTE non ha indotto cambiamenti nell'intensità della risposta e nelle soglie acustiche. I nostri dati dimostrano che la neuroinfiammazione acuta sensibilizza neuroni ai campi elettromagnetici ad alta energia (LTE-EMF), con conseguente alterazione dell'elaborazione degli stimoli acustici nell'ACx.
L'ambiente elettromagnetico dell'umanità è cambiato radicalmente negli ultimi tre decenni a causa della continua espansione delle comunicazioni wireless. Attualmente, più di due terzi della popolazione sono considerati utenti di telefonia mobile (MP). La diffusione su larga scala di questa tecnologia ha suscitato preoccupazioni e dibattiti sugli effetti potenzialmente pericolosi dei campi elettromagnetici pulsati (EMF) nella gamma di radiofrequenza (RF), che vengono emessi da MP o stazioni base e codificano le comunicazioni. Questo problema di salute pubblica ha ispirato una serie di studi sperimentali dedicati all'indagine sugli effetti dell'assorbimento di radiofrequenza nei tessuti biologici1. Alcuni di questi studi hanno cercato cambiamenti nell'attività della rete neuronale e nei processi cognitivi, data la vicinanza del cervello alle sorgenti RF sotto l'uso pervasivo di MP. Molti studi riportati affrontano gli effetti dei segnali modulati a impulsi utilizzati nel sistema globale per le comunicazioni mobili (GSM) di seconda generazione (2G) o nei sistemi di accesso multiplo a divisione di codice a banda larga (WCDMA)/sistemi di telecomunicazioni mobili universali di terza generazione (WCDMA/3G UMTS)2,3,4,5. Si sa poco sugli effetti dei segnali a radiofrequenza utilizzato nei servizi mobili di quarta generazione (4G), che si basano su una tecnologia di protocollo Internet completamente digitale denominata tecnologia Long Term Evolution (LTE). Lanciato nel 2011, si prevede che il servizio di telefonia mobile LTE raggiungerà 6,6 miliardi di abbonati LTE in tutto il mondo nel gennaio 2022 (GSMA: //gsacom.com). Rispetto ai sistemi GSM (2G) e WCDMA (3G) basati su schemi di modulazione a portante singola, LTE utilizza l'Orthogonal Frequency Division Multiplexing (OFDM) come formato di segnale di base6. In tutto il mondo, i servizi mobili LTE utilizzano una gamma di diverse bande di frequenza tra 450 e 3700 MHz, comprese le bande da 900 e 1800 MHz utilizzate anche nel GSM.
La capacità dell'esposizione alle radiofrequenze di influenzare i processi biologici è in gran parte determinata dal tasso di assorbimento specifico (SAR) espresso in W/kg, che misura l'energia assorbita nel tessuto biologico. Gli effetti dell'esposizione acuta della testa per 30 minuti a segnali LTE a 2,573 GHz sull'attività della rete neuronale globale sono stati recentemente esplorati in volontari umani sani. Utilizzando la risonanza magnetica funzionale (fMRI) a riposo, è stato osservato che l'esposizione a LTE può indurre fluttuazioni spontanee di frequenza lenta e alterazioni nella connettività intra- o interregionale, mentre i livelli di picco spaziale SAR medi su 10 g di tessuto sono stati stimati variare tra 0,42 e 1,52 W/kg, secondo gli argomenti 7, 8, 9. L'analisi EEG in condizioni di esposizione simili (durata di 30 minuti, livello di picco SAR stimato di 1,34 W/kg utilizzando un modello rappresentativo della testa umana) ha dimostrato una potenza spettrale ridotta e una coerenza emisferica nelle bande alfa e beta. Tuttavia, altri due studi basati sull'analisi EEG hanno rilevato che 20 o 30 minuti di esposizione della testa a LTE, con il massimo livelli SAR locali fissati a circa 2 W/kg, o non hanno avuto alcun effetto rilevabile11 o hanno determinato una diminuzione della potenza spettrale nella banda alfa, mentre la cognizione non è cambiata nella funzione valutata con il test di Stroop 12. Sono state riscontrate differenze significative anche nei risultati degli studi EEG o cognitivi che esaminavano specificamente gli effetti dell'esposizione ai campi elettromagnetici GSM o UMTS. Si ritiene che derivino da variazioni nella progettazione del metodo e nei parametri sperimentali, tra cui tipo e modulazione del segnale, intensità e durata dell'esposizione, o dall'eterogeneità nei soggetti umani rispetto ad età, anatomia o sesso.
Finora, sono stati utilizzati pochi studi sugli animali per determinare in che modo l'esposizione alla segnalazione LTE influenzi la funzione cerebrale. È stato recentemente riportato che l'esposizione sistemica di topi in via di sviluppo dalla fase embrionale tardiva allo svezzamento (30 min/giorno, 5 giorni/settimana, con un SAR medio per tutto il corpo di 0,5 o 1 W/kg) ha provocato alterazioni nei comportamenti motori e dell'appetito in età adulta 14. È stato scoperto che l'esposizione sistemica ripetuta (2 ha al giorno per 6 settimane) nei ratti adulti induce stress ossidativo e riduce l'ampiezza dei potenziali evocati visivi ottenuti dal nervo ottico, con un SAR massimo stimato pari a soli 10 mW/kg15.
Oltre all'analisi su più scale, inclusi i livelli cellulare e molecolare, i modelli di roditori possono essere utilizzati per studiare gli effetti dell'esposizione a RF durante la malattia, come precedentemente focalizzato sui campi elettromagnetici GSM o WCDMA/3G UMTS nel contesto della neuroinfiammazione acuta. Studi hanno dimostrato gli effetti di convulsioni, malattie neurodegenerative o gliomi 16,17,18,19,20.
I roditori iniettati con lipopolisaccaridi (LPS) rappresentano un modello preclinico classico di risposte neuroinfiammatorie acute associate a malattie infettive benigne causate da virus o batteri che colpiscono la maggior parte della popolazione ogni anno. Questo stato infiammatorio porta a una malattia reversibile e a una sindrome comportamentale depressiva caratterizzata da febbre, perdita di appetito e ridotta interazione sociale. I fagociti residenti nel SNC, come la microglia, sono cellule effettrici chiave di questa risposta neuroinfiammatoria. Il trattamento dei roditori con LPS innesca l'attivazione della microglia caratterizzata da un rimodellamento della loro forma e dei processi cellulari e da profondi cambiamenti nel profilo del trascrittoma, tra cui la sovraregolazione dei geni che codificano citochine o enzimi pro-infiammatori, che influenzano le reti neuronali Attività 22, 23, 24.
Studiando gli effetti di una singola esposizione della testa di 2 ore a campi elettromagnetici GSM-1800 MHz in ratti trattati con LPS, abbiamo scoperto che la segnalazione GSM innesca risposte cellulari nella corteccia cerebrale, influenzando l'espressione genica, la fosforilazione del recettore del glutammato, l'attivazione neuronale meta-evocata e la morfologia della microglia nella corteccia cerebrale. Questi effetti non sono stati rilevati in ratti sani che hanno ricevuto la stessa esposizione a GSM, suggerendo che lo stato neuroinfiammatorio innescato da LPS sensibilizza le cellule del SNC alla segnalazione GSM. Concentrandoci sulla corteccia uditiva (ACx) dei ratti trattati con LPS, dove il SAR locale era in media di 1,55 W/kg, abbiamo osservato che l'esposizione a GSM ha determinato un aumento della lunghezza o della ramificazione dei processi microgliali e una diminuzione delle risposte neuronali evocate da toni puri e .Stimolazione naturale 28.
Nello studio attuale, ci siamo prefissati di esaminare se l'esposizione della sola testa ai segnali LTE-1800 MHz potesse anche alterare la morfologia microgliale e l'attività neuronale nell'ACx, riducendo di due terzi la potenza dell'esposizione. Dimostriamo qui che la segnalazione LTE non ha avuto alcun effetto sui processi microgliali ma ha comunque innescato una significativa riduzione dell'attività corticale evocata dal suono nell'ACx dei ratti trattati con LPS con un valore SAR di 0,5 W/kg.
Considerate le precedenti prove secondo cui l'esposizione a GSM-1800 MHz altera la morfologia della microglia in condizioni pro-infiammatorie, abbiamo studiato questo effetto dopo l'esposizione alla segnalazione LTE.
Ratti adulti sono stati iniettati con LPS 24 ore prima dell'esposizione fittizia della sola testa o dell'esposizione a LTE-1800 MHz. Dopo l'esposizione, le risposte neuroinfiammatorie innescate da LPS sono state stabilite nella corteccia cerebrale, come mostrato dalla sovraregolazione dei geni proinfiammatori e dai cambiamenti nella morfologia della microglia corticale (Figura 1). La potenza esposta dalla testa LTE è stata impostata per ottenere un livello SAR medio di 0,5 W/kg in ACx (Figura 2). Per determinare se la microglia attivata da LPS fosse reattiva ai campi elettromagnetici LTE, abbiamo analizzato sezioni corticali colorate con anti-Iba1 che etichettavano selettivamente queste cellule. Come mostrato nella Figura 3a, nelle sezioni ACx fissate da 3 a 4 ore dopo l'esposizione fittizia o LTE, la microglia appariva notevolmente simile, mostrando una morfologia cellulare "densa" provocata dal trattamento proinfiammatorio con LPS (Figura 1). In linea con l'assenza di risposte morfologiche, l'analisi quantitativa delle immagini non ha rivelato differenze significative nell'area totale (non appaiata t-test, p = 0,308) o area (p = 0,196) e densità (p = 0,061) dell'immunoreattività Iba1 confrontando l'esposizione ai corpi cellulari colorati con Iba 1 nei ratti LTE rispetto agli animali esposti in modo fittizio (Fig. 3b-d).
Effetti dell'iniezione intraperitoneale di LPS sulla morfologia della microglia corticale. Vista rappresentativa della microglia in una sezione coronale della corteccia cerebrale (regione dorsomediale) 24 ore dopo l'iniezione intraperitoneale di LPS o veicolo (controllo). Le cellule sono state colorate con l'anticorpo anti-Iba1 come descritto in precedenza. Il trattamento proinfiammatorio con LPS ha determinato cambiamenti nella morfologia della microglia, tra cui ispessimento prossimale e aumento dei rami secondari corti dei processi cellulari, con conseguente aspetto "denso". Barra della scala: 20 µm.
Analisi dosimetrica del tasso di assorbimento specifico (SAR) nel cervello di ratto durante l'esposizione a 1800 MHz LTE. Un modello eterogeneo precedentemente descritto di ratto fantasma e antenna ad anello62 è stato utilizzato per valutare il SAR locale nel cervello, con una griglia cubica di 0,5 mm3. (a) Vista globale di un modello di ratto in un ambiente di esposizione con un'antenna ad anello sopra la testa e un cuscinetto termico metallico (giallo) sotto il corpo. (b) Distribuzione dei valori SAR nel cervello adulto a una risoluzione spaziale di 0,5 mm3. L'area delimitata dal contorno nero nella sezione sagittale corrisponde alla corteccia uditiva primaria dove viene analizzata l'attività microgliale e neuronale. La scala codificata a colori dei valori SAR si applica a tutte le simulazioni numeriche mostrate nella figura.
Microglia iniettata con LPS nella corteccia uditiva del ratto dopo esposizione a LTE o Sham. (a) Vista rappresentativa impilata di microglia colorata con anticorpo anti-Iba1 in sezioni coronali di corteccia uditiva del ratto perfusa con LPS da 3 a 4 ore dopo l'esposizione a Sham o LTE (esposizione). Barra della scala: 20 µm. (bd) Valutazione morfometrica della microglia da 3 a 4 ore dopo l'esposizione a sham (punti vuoti) o LTE (esposta, punti neri). (b, c) Copertura spaziale (b) del marcatore della microglia Iba1 e aree dei corpi cellulari positivi a Iba1 (c). I dati rappresentano l'area di colorazione anti-Iba1 normalizzata alla media degli animali esposti a Sham. (d) Conteggio dei corpi cellulari microgliali colorati con anti-Iba1. Le differenze tra gli animali Sham (n = 5) e LTE (n = 6) non erano significative (p > 0,05, t-test non accoppiato). La parte superiore e nella parte inferiore del riquadro, le linee superiore e inferiore rappresentano rispettivamente il 25°-75° percentile e il 5°-95° ​​percentile. Il valore medio è contrassegnato in rosso nel riquadro.
La Tabella 1 riassume il numero di animali e le registrazioni multi-unità ottenute nella corteccia uditiva primaria di quattro gruppi di ratti (Sham, Exposed, Sham-LPS, Exposed-LPS). Nei risultati sottostanti, includiamo tutte le registrazioni che presentano un campo recettivo temporale spettrale (STRF) significativo, ovvero risposte evocate da toni almeno 6 deviazioni standard superiori alle frequenze di scarica spontanee (vedere Tabella 1). Applicando questo criterio, abbiamo selezionato 266 registrazioni per il gruppo Sham, 273 registrazioni per il gruppo Exposed, 299 registrazioni per il gruppo Sham-LPS e 295 registrazioni per il gruppo Exposed-LPS.
Nei paragrafi seguenti, descriveremo innanzitutto i parametri estratti dal campo recettivo spettrale-temporale (ovvero la risposta ai toni puri) e la risposta alle vocalizzazioni xenogeniche specifiche. Descriveremo quindi la quantificazione dell'area di risposta in frequenza ottenuta per ciascun gruppo. Considerando la presenza di "dati annidati"30 nel nostro disegno sperimentale, tutte le analisi statistiche sono state eseguite in base al numero di posizioni nella matrice di elettrodi (ultima riga della Tabella 1), ma tutti gli effetti descritti di seguito si basavano anche sul numero di posizioni in ciascun gruppo. Numero totale di registrazioni multi-unità raccolte (terza riga della Tabella 1).
La figura 4a mostra la distribuzione di frequenza ottimale (BF, che provoca la risposta massima a 75 dB SPL) dei neuroni corticali ottenuti negli animali Sham trattati con LPS e in quelli esposti. L'intervallo di frequenza di BF in entrambi i gruppi è stato esteso da 1 kHz a 36 kHz. L'analisi statistica ha mostrato che queste distribuzioni erano simili (chi-quadrato, p = 0,278), suggerendo che i confronti tra i due gruppi potevano essere effettuati senza bias di campionamento.
Effetti dell'esposizione a LTE sui parametri quantificati delle risposte corticali negli animali trattati con LPS. (a) Distribuzione di BF nei neuroni corticali degli animali trattati con LPS esposti a LTE (nero) e esposti in modo fittizio a LTE (bianco). Non vi è alcuna differenza tra le due distribuzioni. (bf) L'effetto dell'esposizione a LTE sui parametri che quantificano il campo recettivo temporale spettrale (STRF). La forza della risposta è stata significativamente ridotta (*p < 0,05, t-test non accoppiato) sia su STRF (forza della risposta totale) che sulle frequenze ottimali (b, c). Durata della risposta, larghezza di banda della risposta e costante di larghezza di banda (df). Sia la forza che l'affidabilità temporale delle risposte alle vocalizzazioni sono state ridotte (g, h). L'attività spontanea non è stata significativamente ridotta (i). (*p < 0,05, t-test non accoppiato). (j, k) Effetti dell'esposizione a LTE sulle soglie corticali. Le soglie medie erano significativamente più alte nei ratti esposti a LTE rispetto a ratti esposti a radiazioni fittizie. Questo effetto è più pronunciato nelle basse e medie frequenze.
Le figure 4b-f mostrano la distribuzione dei parametri derivati ​​dallo STRF per questi animali (medie indicate dalle linee rosse). Gli effetti dell'esposizione a LTE sugli animali trattati con LPS sembravano indicare una diminuzione dell'eccitabilità neuronale. In primo luogo, l'intensità della risposta complessiva e le risposte erano significativamente inferiori negli animali BF rispetto agli animali Sham-LPS (Fig. 4b,c t-test non accoppiato, p = 0,0017; e p = 0,0445). Allo stesso modo, le risposte ai suoni di comunicazione sono diminuite sia nella forza della risposta che nell'affidabilità inter-prova (Fig. 4g,h; t-test non accoppiato, p = 0,043). L'attività spontanea è stata ridotta, ma questo effetto non era significativo (Fig. 4i; p = 0,0745). La durata della risposta, la larghezza di banda di sintonizzazione e la latenza della risposta non sono state influenzate dall'esposizione a LTE negli animali trattati con LPS (Fig. 4d–f), indicando che la selettività di frequenza e la precisione delle risposte di inizio non sono state influenzate dall'esposizione a LTE in Animali trattati con LPS.
Successivamente abbiamo valutato se le soglie corticali dei toni puri fossero alterate dall'esposizione a LTE. Dall'area di risposta in frequenza (FRA) ottenuta da ciascuna registrazione, abbiamo determinato le soglie uditive per ciascuna frequenza e abbiamo calcolato la media di queste soglie per entrambi i gruppi di animali. La Figura 4j mostra le soglie medie (± sem) da 1,1 a 36 kHz nei ratti trattati con LPS. Il confronto delle soglie uditive dei gruppi Sham ed Exposed ha mostrato un aumento sostanziale delle soglie negli animali esposti rispetto agli animali Sham (Fig. 4j), un effetto che era più pronunciato nelle basse e medie frequenze. Più precisamente, alle basse frequenze (< 2,25 kHz), la proporzione di neuroni A1 con soglia alta è aumentata, mentre la proporzione di neuroni a soglia bassa e media è diminuita (chi-quadrato = 43,85; p < 0,0001; Fig. 4k, Figura a sinistra). Lo stesso effetto è stato osservato a media frequenza (2,25 < Freq(kHz) < 11): una proporzione maggiore di registrazioni corticali con soglie intermedie e una proporzione minore di neuroni con soglie basse rispetto al gruppo non esposto (Chi-quadrato = 71,17; p < 0,001; Figura 4k, pannello centrale). C'era anche una differenza significativa nella soglia per i neuroni ad alta frequenza (≥ 11 kHz, p = 0,0059); la proporzione di neuroni a bassa soglia è diminuita e la proporzione di neuroni a soglia medio-alta è aumentata (chi-quadrato = 10,853; p = 0,04 Figura 4k, pannello destro).
La figura 5a mostra la distribuzione di frequenza ottimale (BF, che provoca la risposta massima a 75 dB SPL) dei neuroni corticali ottenuta negli animali sani per i gruppi Sham ed Exposed. L'analisi statistica ha mostrato che le due distribuzioni erano simili (chi-quadrato, p = 0,157), suggerendo che i confronti tra i due gruppi potevano essere effettuati senza bias di campionamento.
Effetti dell'esposizione a LTE sui parametri quantificati delle risposte corticali in animali sani. (a) Distribuzione BF nei neuroni corticali di animali sani esposti a LTE (blu scuro) ed esposti in modo simulato a LTE (blu chiaro). Non vi è alcuna differenza tra le due distribuzioni. (bf) L'effetto dell'esposizione a LTE sui parametri che quantificano il campo recettivo temporale spettrale (STRF). Non vi è stato alcun cambiamento significativo nell'intensità della risposta attraverso lo STRF e le frequenze ottimali (b, c). Vi è un leggero aumento nella durata della risposta (d), ma nessun cambiamento nella larghezza di banda della risposta e nella larghezza di banda (e, f). Né la forza né l'affidabilità temporale delle risposte alle vocalizzazioni sono cambiate (g, h). Non vi è stato alcun cambiamento significativo nell'attività spontanea (i). (*p < 0,05 t-test non accoppiato). (j, k) Effetti dell'esposizione a LTE sulle soglie corticali. In media, le soglie non sono cambiate significativamente nei ratti esposti a LTE rispetto ai ratti esposti in modo simulato, ma le soglie di frequenza più elevate erano leggermente inferiori nei ratti esposti animali.
Le figure 5b-f mostrano boxplot che rappresentano la distribuzione e la media (linea rossa) dei parametri derivati ​​dai due set di STRF. Negli animali sani, l'esposizione a LTE stessa ha avuto scarso effetto sul valore medio dei parametri STRF. Rispetto al gruppo Sham (caselle blu chiaro vs blu scuro per il gruppo esposto), l'esposizione a LTE non ha alterato né l'intensità della risposta totale né la risposta di BF (Fig. 5b,c; test t non accoppiato, p = 0,2176 e p = 0,8696 rispettivamente). Non c'è stato alcun effetto sulla larghezza di banda spettrale e sulla latenza (p = 0,6764 e p = 0,7129, rispettivamente), ma c'è stato un aumento significativo nella durata della risposta (p = 0,047). Non c'è stato alcun effetto sulla forza delle risposte di vocalizzazione (Fig. 5g, p = 0,4375), sull'affidabilità inter-prova di queste risposte (Fig. 5h, p = 0,3412) e sull'attività spontanea (Fig. 5).5i; p = 0,3256).
La figura 5j mostra le soglie medie (± sem) da 1,1 a 36 kHz nei ratti sani. Non è stata evidenziata una differenza significativa tra ratti sottoposti a placebo ed esposti, fatta eccezione per una soglia leggermente inferiore negli animali esposti ad alte frequenze (11–36 kHz) (t-test non accoppiato, p = 0,0083). Questo effetto riflette il fatto che negli animali esposti, in questo intervallo di frequenza (chi-quadrato = 18,312, p = 0,001; Fig. 5k), c'erano leggermente più neuroni con soglie basse e medie (mentre con soglie alte c'erano meno neuroni).
In conclusione, quando gli animali sani sono stati esposti a LTE, non si è verificato alcun effetto sulla forza di risposta ai toni puri e ai suoni complessi come le vocalizzazioni. Inoltre, negli animali sani, le soglie uditive corticali erano simili tra gli animali esposti e quelli simulati, mentre negli animali trattati con LPS, l'esposizione a LTE ha determinato un aumento sostanziale delle soglie corticali, soprattutto nella gamma delle basse e medie frequenze.
Il nostro studio ha dimostrato che nei ratti maschi adulti affetti da neuroinfiammazione acuta, l'esposizione a LTE-1800 MHz con un SARACx locale di 0,5 W/kg (vedere Metodi) ha determinato una significativa riduzione dell'intensità delle risposte evocate dal suono nelle registrazioni primarie della comunicazione. Questi cambiamenti nell'attività neuronale si sono verificati senza alcuna apparente variazione nell'estensione del dominio spaziale coperto dai processi microgliali. Questo effetto dell'LTE sull'intensità delle risposte evocate corticali non è stato osservato nei ratti sani. Considerando la somiglianza nella distribuzione di frequenza ottimale tra le unità di registrazione negli animali esposti a LTE e in quelli esposti in modo fittizio, le differenze nella reattività neuronale possono essere attribuite agli effetti biologici dei segnali LTE piuttosto che a bias di campionamento (Fig. 4a). Inoltre, l'assenza di cambiamenti nella latenza di risposta e nella larghezza di banda di sintonizzazione spettrale nei ratti esposti a LTE suggerisce che, molto probabilmente, queste registrazioni sono state campionate dagli stessi strati corticali, che si trovano nell'ACx primario piuttosto che nelle regioni secondarie.
A nostra conoscenza, l'effetto della segnalazione LTE sulle risposte neuronali non è stato precedentemente riportato. Tuttavia, studi precedenti hanno documentato la capacità di GSM-1800 MHz o onda continua (CW) a 1800 MHz di alterare l'eccitabilità neuronale, sebbene con differenze significative a seconda dell'approccio sperimentale. Poco dopo l'esposizione a 1800 MHz CW a un livello SAR di 8,2 W/Kg, le registrazioni dai gangli di lumaca hanno mostrato soglie ridotte per l'attivazione di potenziali d'azione e modulazione neuronale. D'altra parte, l'attività di picco e di scoppio nelle colture neuronali primarie derivate dal cervello di ratto è stata ridotta dall'esposizione a GSM-1800 MHz o 1800 MHz CW per 15 minuti a un SAR di 4,6 W/kg. Questa inibizione è stata solo parzialmente reversibile entro 30 minuti dall'esposizione. Il silenziamento completo dei neuroni è stato ottenuto a un SAR di 9,2 W/kg. L'analisi dose-risposta ha mostrato che GSM-1800 MHz è risultato più efficace della CW a 1800 MHz nel sopprimere l'attività burst, suggerendo che le risposte neuronali dipendono dalla modulazione del segnale RF.
Nel nostro contesto, le risposte corticali evocate sono state raccolte in vivo da 3 a 6 ore dopo la fine dell'esposizione di 2 ore alla sola testa. In uno studio precedente, abbiamo studiato l'effetto di GSM-1800 MHz a SARACx di 1,55 W/kg e non abbiamo riscontrato alcun effetto significativo sulle risposte corticali evocate dal suono nei ratti sani. Qui, l'unico effetto significativo evocato nei ratti sani dall'esposizione a LTE-1800 a 0,5 W/kg SARACx è stato un leggero aumento della durata della risposta alla presentazione di toni puri. Questo effetto è difficile da spiegare perché non è accompagnato da un aumento dell'intensità della risposta, suggerendo che questa maggiore durata della risposta si verifica con lo stesso numero totale di potenziali d'azione attivati ​​dai neuroni corticali. Una spiegazione potrebbe essere che l'esposizione a LTE può ridurre l'attività di alcuni interneuroni inibitori, poiché è stato documentato che nell'ACx primario l'inibizione feedforward controlla la durata delle risposte delle cellule piramidali innescate dall'input talamico eccitatorio33,34, 35, 36, 37.
Al contrario, nei ratti sottoposti a neuroinfiammazione innescata da LPS, l'esposizione a LTE non ha avuto alcun effetto sulla durata dell'attivazione neuronale evocata dal suono, ma sono stati rilevati effetti significativi sulla forza delle risposte evocate. Infatti, rispetto alle risposte neuronali registrate nei ratti esposti a LPS-sham, i neuroni nei ratti trattati con LPS esposti a LTE hanno mostrato una riduzione nell'intensità delle loro risposte, un effetto osservato sia quando presentavano toni puri che vocalizzazioni naturali. La riduzione nell'intensità della risposta ai toni puri si è verificata senza un restringimento della larghezza di banda di sintonizzazione spettrale di 75 dB e, poiché si è verificata a tutte le intensità sonore, ha determinato un aumento delle soglie acustiche dei neuroni corticali alle basse e medie frequenze.
La riduzione dell'intensità della risposta evocata ha indicato che l'effetto della segnalazione LTE a SARACx di 0,5 W/kg negli animali trattati con LPS era simile a quello di GSM-1800 MHz applicato a SARACx tre volte superiore (1,55 W/kg) 28. Per quanto riguarda la segnalazione GSM, l'esposizione della testa a LTE-1800 MHz può ridurre l'eccitabilità neuronale nei neuroni ACx del ratto sottoposti a neuroinfiammazione innescata da LPS. In linea con questa ipotesi, abbiamo anche osservato una tendenza verso una diminuzione dell'affidabilità della prova delle risposte neuronali alla vocalizzazione (Fig. 4h) e una diminuzione dell'attività spontanea (Fig. 4i). Tuttavia, è stato difficile determinare in vivo se la segnalazione LTE riduce l'eccitabilità intrinseca neuronale o riduce l'input sinaptico, controllando così le risposte neuronali in ACx.
In primo luogo, queste risposte più deboli potrebbero essere dovute all'eccitabilità intrinsecamente ridotta delle cellule corticali dopo l'esposizione a LTE 1800 MHz. A supporto di questa idea, GSM-1800 MHz e 1800 MHz-CW hanno ridotto l'attività di burst quando applicati direttamente a colture primarie di neuroni corticali di ratto con livelli SAR rispettivamente di 3,2 W/kg e 4,6 W/kg, ma era necessario un livello SAR soglia per ridurre significativamente l'attività di burst. A sostegno della riduzione dell'eccitabilità intrinseca, abbiamo anche osservato tassi inferiori di attivazione spontanea negli animali esposti rispetto agli animali esposti in modo fittizio.
In secondo luogo, l'esposizione a LTE può anche influenzare la trasmissione sinaptica dalle sinapsi talamo-corticali o cortico-corticali. Numerosi dati mostrano ora che, nella corteccia uditiva, l'ampiezza della sintonizzazione spettrale non è determinata esclusivamente dalle proiezioni talamiche afferenti, ma che le connessioni intracorticali conferiscono un input spettrale aggiuntivo ai siti corticali39,40. Nei nostri esperimenti, il fatto che la STRF corticale mostrasse larghezze di banda simili negli animali esposti e in quelli esposti in modo fittizio suggeriva indirettamente che gli effetti dell'esposizione a LTE non erano effetti sulla connettività cortico-corticale. Ciò suggerisce anche che una connettività più elevata in altre regioni corticali esposte a SAR rispetto a quella misurata in ACx (Fig. 2) potrebbe non essere responsabile delle risposte alterate qui riportate.
In questo caso, una proporzione maggiore di registrazioni corticali esposte a LPS ha mostrato soglie elevate rispetto agli animali esposti a LPS fittizio. Dato che è stato proposto che la soglia acustica corticale sia controllata principalmente dalla forza della sinapsi talamo-corticale39,40, si può sospettare che la trasmissione talamo-corticale sia parzialmente ridotta dall'esposizione, sia a livello presinaptico (riduzione del rilascio di glutammato) sia a livello postsinaptico (riduzione del numero o dell'affinità dei recettori).
Similmente agli effetti del GSM-1800 MHz, le risposte neuronali alterate indotte da LTE si sono verificate nel contesto della neuroinfiammazione innescata da LPS, caratterizzata da risposte microgliali. Le prove attuali suggeriscono che la microglia influenza fortemente l'attività delle reti neuronali nei cervelli normali e patologici41,42,43. La loro capacità di modulare la neurotrasmissione dipende non solo dalla produzione di composti che possono o meno limitare la neurotrasmissione, ma anche dall'elevata motilità dei loro processi cellulari. Nella corteccia cerebrale, sia l'aumento che la diminuzione dell'attività delle reti neuronali innescano una rapida espansione del dominio spaziale microgliale a causa della crescita dei processi microgliali44,45. In particolare, le protrusioni microgliali vengono reclutate vicino alle sinapsi talamocorticali attivate e possono inibire l'attività delle sinapsi eccitatorie attraverso meccanismi che coinvolgono la produzione locale di adenosina mediata dalla microglia.
Nei ratti trattati con LPS sottoposti a GSM-1800 MHz con SARACx a 1,55 W/kg, si è verificata una diminuzione dell'attività dei neuroni ACx con la crescita dei processi microgliali contrassegnati da aree significative colorate con Iba1 nell'aumento di ACx28. Questa osservazione suggerisce che il rimodellamento microgliale innescato dall'esposizione a GSM può contribuire attivamente alla riduzione indotta da GSM nelle risposte neuronali evocate dal suono. Il nostro attuale studio contrasta questa ipotesi nel contesto dell'esposizione della testa a LTE con SARACx limitato a 0,5 W/kg, poiché non abbiamo riscontrato alcun aumento nel dominio spaziale coperto dai processi microgliali. Tuttavia, ciò non esclude alcun effetto della segnalazione LTE sulla microglia attivata da LPS, che a sua volta può influenzare l'attività neuronale. Sono necessari ulteriori studi per rispondere a questa domanda e per determinare i meccanismi con cui la neuroinfiammazione acuta altera le risposte neuronali alla segnalazione LTE.
A nostra conoscenza, l'effetto dei segnali LTE sull'elaborazione uditiva non è stato studiato prima. I nostri studi precedenti 26,28 e lo studio attuale hanno dimostrato che nel contesto di infiammazione acuta, l'esposizione della testa da sola a GSM-1800 MHz o LTE-1800 MHz ha provocato alterazioni funzionali nelle risposte neuronali in ACx, come dimostrato dall'aumento della soglia uditiva. Per almeno due ragioni principali, la funzione cocleare non dovrebbe essere influenzata dalla nostra esposizione a LTE. In primo luogo, come mostrato nello studio dosimetrico mostrato nella Figura 2, i livelli più elevati di SAR (vicini a 1 W/kg) si trovano nella corteccia dorsomediale (sotto l'antenna) e diminuiscono sostanzialmente man mano che ci si muove più lateralmente e lateralmente. La parte ventrale della testa. Può essere stimato a circa 0,1 W/kg a livello del padiglione auricolare del ratto (sotto il condotto uditivo). In secondo luogo, quando le orecchie di cavia sono state esposte per 2 mesi a GSM 900 MHz (5 giorni/settimana, 1 ora/giorno, SAR tra 1 e 4 W/kg), non sono stati rilevati cambiamenti nell'entità del prodotto di distorsione Soglie otoacustiche per le risposte di emissione e uditive del tronco encefalico 47. Inoltre, l'esposizione ripetuta della testa a GSM 900 o 1800 MHz a un SAR locale di 2 W/kg non ha influenzato la funzione delle cellule ciliate esterne della coclea nei ratti sani48,49. Questi risultati rispecchiano i dati ottenuti negli esseri umani, dove le indagini hanno dimostrato che un'esposizione di 10-30 minuti ai campi elettromagnetici dei telefoni cellulari GSM non ha alcun effetto coerente sull'elaborazione uditiva come valutato a livello cocleare50,51,52 o del tronco encefalico53,54.
Nel nostro studio, sono stati osservati cambiamenti nell'attività neuronale innescati da LTE in vivo da 3 a 6 ore dopo la fine dell'esposizione. In uno studio precedente sulla parte dorsomediale della corteccia, diversi effetti indotti da GSM-1800 MHz osservati 24 ore dopo l'esposizione non erano più rilevabili 72 ore dopo l'esposizione. Questo è il caso dell'espansione dei processi microgliali, della downregulation del gene IL-1ß e della modifica post-traduzionale dei recettori AMPA. Considerando che la corteccia uditiva ha un valore SAR inferiore (0,5 W/kg) rispetto alla regione dorsomediale (2,94 W/kg26), i cambiamenti nell'attività neuronale qui riportati sembrano essere transitori.
I nostri dati dovrebbero tenere conto dei limiti SAR qualificanti e delle stime dei valori SAR effettivi raggiunti nella corteccia cerebrale degli utenti di telefoni cellulari. Gli standard attuali utilizzati per proteggere il pubblico stabiliscono il limite SAR a 2 W/kg per l'esposizione localizzata della testa o del busto alle radiofrequenze nell'intervallo RF da 100 kHz e 6 GHz.
Sono state eseguite simulazioni di dose utilizzando diversi modelli di testa umana per determinare l'assorbimento di potenza RF in diversi tessuti della testa durante la comunicazione generale tramite testa o telefono cellulare. Oltre alla diversità dei modelli di testa umana, queste simulazioni evidenziano differenze o incertezze significative nella stima dell'energia assorbita dal cervello in base a parametri anatomici o istologici come la forma esterna o interna del cranio, lo spessore o il contenuto di acqua. I diversi tessuti della testa variano ampiamente in base all'età, al sesso o all'individuo 56,57,58. Inoltre, le caratteristiche del telefono cellulare, come la posizione interna dell'antenna e la posizione del telefono cellulare rispetto alla testa dell'utente, influenzano fortemente il livello e la distribuzione dei valori SAR nella corteccia cerebrale 59,60. Tuttavia, considerando le distribuzioni SAR riportate nella corteccia cerebrale umana, che sono state stabilite da modelli di telefono cellulare che emettono frequenze radio nell'intervallo di 1800 MHz 58, 59, 60, sembra che i livelli SAR raggiunti nella corteccia uditiva umana siano ancora sotto-applicati metà della corteccia cerebrale umana corteccia.Il nostro studio (SARACx 0,5 W/kg).Pertanto, i nostri dati non mettono in discussione gli attuali limiti dei valori SAR applicabili al pubblico.
In conclusione, il nostro studio dimostra che un'unica esposizione della testa a LTE-1800 MHz interferisce con le risposte neuronali dei neuroni corticali agli stimoli sensoriali. In linea con le precedenti caratterizzazioni degli effetti della segnalazione GSM, i nostri risultati suggeriscono che gli effetti della segnalazione LTE sull'attività neuronale variano a seconda dello stato di salute. La neuroinfiammazione acuta sensibilizza i neuroni a LTE-1800 MHz, con conseguente alterazione dell'elaborazione corticale degli stimoli uditivi.
I dati sono stati raccolti a 55 giorni di età dalla corteccia cerebrale di 31 ratti maschi adulti Wistar ottenuti nel laboratorio Janvier. I ratti sono stati alloggiati in una struttura con umidità (50-55%) e temperatura (22-24 °C) controllate con un ciclo luce/buio di 12 h/12 ​​h (luci accese alle 7:30) con libero accesso a cibo e acqua. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida stabilite dalla Direttiva del Consiglio delle Comunità Europee (Direttiva del Consiglio 2010/63/UE), che sono simili a quelle descritte nelle Linee guida della Società per le Neuroscienze per l'uso di animali nella ricerca neuroscientifica. Questo protocollo è stato approvato dal Comitato Etico Paris-Sud e Centro (CEEA N°59, Progetto 2014-25, Protocollo Nazionale 03729.02) utilizzando procedure convalidate da questo comitato 32-2011 e 34-2012.
Gli animali sono stati abituati alle camere delle colonie per almeno 1 settimana prima del trattamento con LPS e dell'esposizione (o esposizione fittizia) a LTE-EMF.
Ventidue ratti sono stati iniettati per via intraperitoneale (ip) con E. coli LPS (250 µg/kg, sierotipo 0127:B8, SIGMA) diluito con soluzione salina isotonica sterile priva di endotossine 24 ore prima dell'LTE o dell'esposizione fittizia (n per gruppo). = 11). Nei ratti maschi Wistar di 2 mesi, questo trattamento con LPS produce una risposta neuroinfiammatoria che è marcata nella corteccia cerebrale da diversi geni pro-infiammatori (fattore di necrosi tumorale alfa, interleuchina 1ß, CCL2, NOX2, NOS2) che sono stati sovraregolati 24 ore dopo l'iniezione di LPS, incluso un aumento di 4 e 12 volte nei livelli di trascrizioni che codificano rispettivamente l'enzima NOX2 e l'interleuchina 1ß. A questo punto temporale di 24 ore, la microglia corticale ha mostrato la tipica morfologia cellulare "densa" prevista dall'attivazione pro-infiammatoria delle cellule innescata da LPS (Figura 1), che è in contrasto con l'attivazione innescata da LPS da parte di altri. L'attivazione pro-infiammatoria cellulare corrisponde a 24, 61.
L'esposizione della sola testa ai campi elettromagnetici LTE è stata eseguita utilizzando la configurazione sperimentale precedentemente utilizzata per valutare l'effetto dei campi elettromagnetici GSM26. L'esposizione a LTE è stata eseguita 24 ore dopo l'iniezione di LPS (11 animali) o nessun trattamento con LPS (5 animali). Gli animali sono stati leggermente anestetizzati con ketamina/xilazina (ketamina 80 mg/kg, ip; xilazina 10 mg/kg, ip) prima dell'esposizione per impedire il movimento e per garantire che la testa dell'animale fosse nell'antenna a loop che emetteva il segnale LTE. Posizione riproducibile di seguito. Metà dei ratti della stessa gabbia è servita come controllo (11 animali esposti in modo fittizio, su 22 ratti pretrattati con LPS): sono stati posizionati sotto l'antenna a loop e l'energia del segnale LTE è stata impostata su zero. I pesi degli animali esposti e esposti in modo fittizio erano simili (p = 0,558, t-test non accoppiato, ns). Tutti gli animali anestetizzati sono stati posizionati su un termoforo privo di metallo per mantenere la loro temperatura corporea intorno a 37°C per tutta la durata dell'esperimento. Come negli esperimenti precedenti, il tempo di esposizione è stato impostato su 2 ore. Dopo l'esposizione, posizionare l'animale su un altro termoforo nella sala operatoria. La stessa procedura di esposizione è stata applicata a 10 ratti sani (non trattati con LPS), metà dei quali sono stati esposti in modo fittizio dalla stessa gabbia (p = 0,694).
Il sistema di esposizione era simile ai sistemi 25, 62 descritti in studi precedenti, con il generatore di radiofrequenza sostituito per generare campi elettromagnetici LTE invece di GSM. In breve, un generatore RF (SMBV100A, 3,2 GHz, Rohde & Schwarz, Germania) che emetteva un campo elettromagnetico LTE - 1800 MHz era collegato a un amplificatore di potenza (ZHL-4W-422+, Mini-Circuits, USA), un circolatore (D3 1719-N, Sodhy, Francia), un accoppiatore bidirezionale (CD D 1824-2, − 30 dB, Sodhy, Francia) e un divisore di potenza a quattro vie (DC D 0922-4N, Sodhy, Francia), consentendo l'esposizione simultanea di quattro animali. Un misuratore di potenza (N1921A, Agilent, USA) collegato a un accoppiatore bidirezionale consentiva la misurazione e il monitoraggio continui della potenza incidente e riflessa all'interno del dispositivo. Ogni uscita era collegata a un'antenna a loop (Sama-Sistemi srl; Roma), consentendo l'esposizione parziale della testa dell'animale. L'antenna a loop è costituita da un circuito stampato con due linee metalliche (costante dielettrica εr = 4,6) incise su un substrato epossidico isolante. Ad un'estremità, il dispositivo è costituito da un filo largo 1 mm che forma un anello posizionato vicino alla testa dell'animale. Come in studi precedenti26,62, il tasso di assorbimento specifico (SAR) è stato determinato numericamente utilizzando un modello numerico di ratto e un metodo nel dominio del tempo delle differenze finite (FDTD)63,64,65. Sono stati inoltre determinati sperimentalmente in un modello di ratto omogeneo utilizzando sonde Luxtron per misurare l'aumento di temperatura. In questo caso, il SAR in W/kg viene calcolato utilizzando la formula: SAR = C ΔT/Δt, dove C è la capacità termica in J/(kg K), ΔT, in °K e Δt variazione di temperatura, tempo in secondi. I valori SAR determinati numericamente sono stati confrontati con i valori SAR sperimentali ottenuti utilizzando un modello omogeneo, soprattutto nelle regioni equivalenti del cervello del ratto. La differenza tra le misurazioni SAR numeriche e i valori SAR rilevati sperimentalmente è inferiore al 30%.
La Figura 2a mostra la distribuzione del SAR nel cervello del ratto nel modello di ratto, che corrisponde alla distribuzione in termini di peso corporeo e dimensioni dei ratti utilizzati nel nostro studio. Il SAR medio del cervello era 0,37 ± 0,23 W/kg (media ± DS). I valori SAR sono più alti nell'area corticale appena sotto l'antenna a loop. Il SAR locale in ACx (SARACx) era 0,50 ± 0,08 W/kg (media ± DS) (Fig. 2b). Poiché i pesi corporei dei ratti esposti sono omogenei e le differenze nello spessore del tessuto cranico sono trascurabili, ci si aspetta che il SAR effettivo di ACx o di altre aree corticali sia molto simile tra un animale esposto e l'altro.
Al termine dell'esposizione, agli animali sono state somministrate dosi aggiuntive di ketamina (20 mg/kg, ip) e xilazina (4 mg/kg, ip) finché non sono stati osservati movimenti riflessi dopo aver pizzicato la zampa posteriore. Un anestetico locale (Xylocain 2%) è stato iniettato per via sottocutanea nella pelle e nel muscolo temporale sopra il cranio e gli animali sono stati posizionati su un sistema di riscaldamento privo di metallo. Dopo aver posizionato l'animale nel telaio stereotassico, è stata eseguita una craniotomia sulla corteccia temporale sinistra. Come nel nostro studio precedente66, partendo dalla giunzione delle ossa parietali e temporali, l'apertura era larga 9 mm e alta 5 mm. La dura madre sopra l'ACx è stata rimossa con attenzione sotto controllo binoculare senza danneggiare i vasi sanguigni. Al termine della procedura, è stata costruita una base in cemento acrilico dentale per il fissaggio atraumatico della testa dell'animale durante la registrazione. Posizionare il telaio stereotassico che supporta l'animale in una camera di attenuazione acustica (IAC, modello AC1).
I dati sono stati ottenuti da registrazioni multi-unità nella corteccia uditiva primaria di 20 ratti, inclusi 10 animali pretrattati con LPS. Le registrazioni extracellulari sono state ottenute da una serie di 16 elettrodi di tungsteno (TDT, ø: 33 µm, < 1 MΩ) costituiti da due file di 8 elettrodi distanziati di 1000 µm (350 µm tra gli elettrodi nella stessa fila). Un filo d'argento (ø: 300 µm) per la messa a terra è stato inserito tra l'osso temporale e la dura controlaterale. La posizione stimata dell'ACx primario è 4-7 mm posteriormente al bregma e 3 mm ventralmente alla sutura sopratemporale. Il segnale grezzo è stato amplificato 10.000 volte (TDT Medusa) e quindi elaborato da un sistema di acquisizione dati multicanale (RX5, TDT). I segnali raccolti da ciascun elettrodo sono stati filtrati (610–10.000 Hz) per estrarre l'attività multi-unità (MUA). I ​​livelli di trigger sono stati impostati con cura per ciascun elettrodo (da coautori ignari degli stati esposti o di esposizione fittizia) per selezionare il potenziale d'azione più grande dal segnale. L'ispezione online e offline delle forme d'onda ha mostrato che i MUA raccolti qui consistevano in potenziali d'azione generati da 3 a 6 neuroni vicino agli elettrodi. All'inizio di ogni esperimento, abbiamo impostato la posizione della matrice di elettrodi in modo che due file di otto elettrodi potessero campionare i neuroni, dalle risposte a bassa ad alta frequenza quando eseguite nell'orientamento rostrale.
Gli stimoli acustici sono stati generati in Matlab, trasmessi a un sistema di trasmissione del suono (TDT) basato su RP2.1 e inviati a un altoparlante Fostex (FE87E). L'altoparlante è stato posizionato a 2 cm dall'orecchio destro del ratto, distanza a cui l'altoparlante ha prodotto uno spettro di frequenza piatto (± 3 dB) tra 140 Hz e 36 kHz. La calibrazione dell'altoparlante è stata eseguita utilizzando rumore e toni puri registrati con un microfono Bruel e Kjaer 4133 accoppiato a un preamplificatore B&K 2169 e un registratore digitale Marantz PMD671. Il campo recettivo temporale spettrale (STRF) è stato determinato utilizzando 97 frequenze gamma-tono, che coprono 8 ottave (0,14–36 kHz), presentate in ordine casuale a 75 dB SPL a 4,15 Hz. L'area di risposta in frequenza (FRA) è determinata utilizzando lo stesso set di toni e presentata in ordine casuale a 2 Hz da 75 a 5 dB SPL. Ogni frequenza viene presentata otto volte a ciascuna intensità.
Sono state valutate anche le risposte agli stimoli naturali. In studi precedenti, abbiamo osservato che le vocalizzazioni dei ratti raramente suscitavano forti risposte in ACx, indipendentemente dalla frequenza ottimale neuronale (BF), mentre le vocalizzazioni specifiche dello xenotrapianto (ad esempio, vocalizzazioni di uccelli canterini o cavie) in genere l'intera mappa dei toni. Pertanto, abbiamo testato le risposte corticali alle vocalizzazioni nelle cavie (il fischio utilizzato in 36 era collegato a 1 s di stimoli, presentati 25 volte).

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