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La crescente domanda di comunicazioni telefoniche mobili ha portato alla continua comparsa di tecnologie wireless (G), che possono avere diversi impatti sui sistemi biologici. Per testare ciò, abbiamo esposto dei ratti a un'esposizione a testa singola a un campo elettromagnetico (CEM) 4G a 1800 MHz (LTE) per 2 ore. Abbiamo quindi valutato l'effetto della neuroinfiammazione acuta indotta da lipopolisaccaridi sulla copertura spaziale della microglia e sull'attività neuronale elettrofisiologica nella corteccia uditiva primaria (ACx). Il SAR medio in ACx è di 0,5 W/kg. Le registrazioni multi-unità mostrano che il CEM LTE innesca una riduzione dell'intensità della risposta a toni puri e vocalizzazioni naturali, mentre un aumento della soglia acustica per le frequenze basse e medie. L'immunoistochimica Iba1 non ha mostrato cambiamenti nell'area coperta da corpi e processi microgliali. Nei ratti sani, la stessa esposizione a LTE non ha indotto cambiamenti nell'intensità della risposta e nelle soglie acustiche. I nostri dati dimostrano che la neuroinfiammazione acuta sensibilizza i neuroni a LTE-EMF, con conseguente alterazione dell'elaborazione degli stimoli acustici nella ACx.
L'ambiente elettromagnetico dell'umanità è cambiato drasticamente negli ultimi tre decenni a causa della continua espansione delle comunicazioni wireless. Attualmente, più di due terzi della popolazione sono considerati utenti di telefoni cellulari. La diffusione su larga scala di questa tecnologia ha suscitato preoccupazioni e dibattiti sui potenziali effetti pericolosi dei campi elettromagnetici pulsati (CEM) nella gamma delle radiofrequenze (RF), emessi dai telefoni cellulari o dalle stazioni base e utilizzati per codificare le comunicazioni. Questo problema di salute pubblica ha ispirato una serie di studi sperimentali dedicati all'indagine degli effetti dell'assorbimento di radiofrequenze nei tessuti biologici1. Alcuni di questi studi hanno cercato cambiamenti nell'attività delle reti neuronali e nei processi cognitivi, data la vicinanza del cervello alle sorgenti RF nell'uso pervasivo dei telefoni cellulari. Molti studi pubblicati affrontano gli effetti dei segnali a modulazione di impulsi utilizzati nel sistema globale di seconda generazione (2G) per le comunicazioni mobili (GSM) o nel sistema di accesso multiplo a divisione di codice a banda larga (WCDMA)/terza generazione di sistemi universali di telecomunicazione mobile (WCDMA/3G UMTS)2,3,4,5. Si sa poco sugli effetti dei segnali a radiofrequenza utilizzati nella quarta generazione. Servizi mobili di quarta generazione (4G), che si basano su una tecnologia di protocollo Internet completamente digitale chiamata tecnologia Long Term Evolution (LTE). Lanciato nel 2011, il servizio di telefonia mobile LTE dovrebbe raggiungere 6,6 miliardi di abbonati LTE a livello globale nel gennaio 2022 (GSMA: //gsacom.com). Rispetto ai sistemi GSM (2G) e WCDMA (3G) basati su schemi di modulazione a portante singola, l'LTE utilizza l'Orthogonal Frequency Division Multiplexing (OFDM) come formato di segnale di base6. A livello mondiale, i servizi mobili LTE utilizzano una gamma di diverse bande di frequenza tra 450 e 3700 MHz, incluse le bande a 900 e 1800 MHz utilizzate anche nel GSM.
La capacità dell'esposizione alle radiofrequenze di influenzare i processi biologici è ampiamente determinata dal tasso di assorbimento specifico (SAR) espresso in W/kg, che misura l'energia assorbita nel tessuto biologico. Gli effetti di un'esposizione acuta di 30 minuti della testa a segnali LTE a 2,573 GHz sull'attività globale della rete neuronale sono stati recentemente esplorati in volontari umani sani. Utilizzando la fMRI a riposo, è stato osservato che l'esposizione a LTE può indurre fluttuazioni spontanee di frequenza lenta e alterazioni nella connettività intra- o interregionale, mentre i livelli SAR di picco spaziali mediati su 10 g di tessuto sono stati stimati variare tra 0,42 e 1,52 W/kg, secondo gli argomenti 7, 8, 9. L'analisi EEG in condizioni di esposizione simili (durata di 30 minuti, livello SAR di picco stimato di 1,34 W/kg utilizzando un modello rappresentativo della testa umana) ha dimostrato una riduzione della potenza spettrale e della coerenza emisferica nelle bande alfa e beta. Tuttavia, altri due studi basati sull'analisi EEG hanno rilevato che 20 o 30 minuti di esposizione della testa a LTE, con livelli SAR locali massimi impostati a circa 2 W/kg, non hanno avuto alcun effetto rilevabile¹¹ oppure hanno comportato una diminuzione della potenza spettrale nella banda alfa, mentre la funzione cognitiva non è cambiata nella valutazione con il test di Stroop¹². Sono state riscontrate differenze significative anche nei risultati di studi EEG o cognitivi che esaminavano specificamente gli effetti dell'esposizione ai campi elettromagnetici GSM o UMTS. Si ritiene che queste differenze derivino da variazioni nella progettazione del metodo e nei parametri sperimentali, tra cui il tipo di segnale e la modulazione, l'intensità e la durata dell'esposizione, o dall'eterogeneità dei soggetti umani rispetto all'età, all'anatomia o al sesso.
Finora, pochi studi sugli animali sono stati utilizzati per determinare come l'esposizione alla segnalazione LTE influenzi la funzione cerebrale. È stato recentemente riportato che l'esposizione sistemica di topi in via di sviluppo dalla fase embrionale avanzata allo svezzamento (30 min/giorno, 5 giorni/settimana, con un SAR medio per tutto il corpo di 0,5 o 1 W/kg) ha provocato alterazioni nei comportamenti motori e nell'appetito in età adulta 14. È stato riscontrato che l'esposizione sistemica ripetuta (2 ettari al giorno per 6 settimane) in ratti adulti induce stress ossidativo e riduce l'ampiezza dei potenziali evocati visivi ottenuti dal nervo ottico, con un SAR massimo stimato pari a soli 10 mW/kg15.
Oltre all'analisi a più livelli, inclusi quelli cellulare e molecolare, i modelli murini possono essere utilizzati per studiare gli effetti dell'esposizione alle radiofrequenze durante le malattie, come precedentemente evidenziato per i campi elettromagnetici GSM o WCDMA/3G UMTS nel contesto della neuroinfiammazione acuta. Gli studi hanno mostrato gli effetti su convulsioni, malattie neurodegenerative o gliomi 16,17,18,19,20.
I roditori trattati con lipopolisaccaride (LPS) rappresentano un classico modello preclinico di risposte neuroinfiammatorie acute associate a malattie infettive benigne causate da virus o batteri che colpiscono la maggior parte della popolazione ogni anno. Questo stato infiammatorio porta a una malattia reversibile e a una sindrome comportamentale depressiva caratterizzata da febbre, perdita di appetito e ridotta interazione sociale. I fagociti residenti del SNC, come la microglia, sono cellule effettrici chiave di questa risposta neuroinfiammatoria. Il trattamento dei roditori con LPS innesca l'attivazione della microglia, caratterizzata da un rimodellamento della loro forma e dei processi cellulari e da profondi cambiamenti nel profilo del trascrittoma, tra cui la sovraregolazione dei geni che codificano citochine o enzimi proinfiammatori, che influenzano le reti neuronali Attività 22, 23, 24.
Studiando gli effetti di una singola esposizione della testa di 2 ore a campi elettromagnetici GSM-1800 MHz in ratti trattati con LPS, abbiamo scoperto che la segnalazione GSM innesca risposte cellulari nella corteccia cerebrale, influenzando l'espressione genica, la fosforilazione del recettore del glutammato, l'attività neuronale evocata da meta-stimolazione e la morfologia della microglia nella corteccia cerebrale. Questi effetti non sono stati rilevati in ratti sani che hanno ricevuto la stessa esposizione a GSM, suggerendo che lo stato neuroinfiammatorio innescato da LPS sensibilizza le cellule del SNC alla segnalazione GSM. Concentrandoci sulla corteccia uditiva (ACx) di ratti trattati con LPS, dove il SAR locale era in media di 1,55 W/kg, abbiamo osservato che l'esposizione a GSM ha determinato un aumento della lunghezza o della ramificazione dei processi microgliali e una diminuzione delle risposte neuronali evocate da toni puri e stimolazione naturale 28.
Nel presente studio, ci siamo proposti di esaminare se l'esposizione della sola testa a segnali LTE-1800 MHz potesse alterare anche la morfologia microgliale e l'attività neuronale nella corteccia uditiva (ACx), riducendo la potenza dell'esposizione di due terzi. Dimostriamo qui che la segnalazione LTE non ha avuto alcun effetto sui processi microgliali, ma ha comunque innescato una significativa riduzione dell'attività corticale evocata dal suono nella ACx di ratti trattati con LPS con un valore SAR di 0,5 W/kg.
Considerate le precedenti evidenze che l'esposizione al GSM-1800 MHz alterava la morfologia microgliale in condizioni pro-infiammatorie, abbiamo studiato questo effetto dopo l'esposizione alla segnalazione LTE.
Ratti adulti sono stati iniettati con LPS 24 ore prima dell'esposizione simulata alla sola testa o dell'esposizione a LTE-1800 MHz. Dopo l'esposizione, sono state stabilite risposte neuroinfiammatorie innescate da LPS nella corteccia cerebrale, come dimostrato dalla sovraregolazione dei geni proinfiammatori e dai cambiamenti nella morfologia della microglia corticale (Figura 1). La potenza esposta dalla testa LTE è stata impostata per ottenere un livello SAR medio di 0,5 W/kg in ACx (Figura 2). Per determinare se la microglia attivata da LPS fosse responsiva al campo elettromagnetico LTE, abbiamo analizzato sezioni corticali colorate con anti-Iba1 che etichettava selettivamente queste cellule. Come mostrato nella Figura 3a, nelle sezioni ACx fissate da 3 a 4 ore dopo l'esposizione simulata o LTE, la microglia appariva notevolmente simile, mostrando una morfologia cellulare "simile a densa" indotta dal trattamento proinfiammatorio con LPS (Figura 1). In linea con l'assenza di risposte morfologiche, l'analisi quantitativa delle immagini non ha rivelato differenze significative nell'area totale (non appaiata) test t, p = 0,308) o area (p = 0,196) e densità (p = 0,061) dell'immunoreattività di Iba1 quando si confronta l'esposizione a corpi cellulari colorati con Iba 1 nei ratti LTE rispetto agli animali esposti a finta esposizione (Fig. 3b-d).
Effetti dell'iniezione intraperitoneale di LPS sulla morfologia della microglia corticale. Vista rappresentativa della microglia in una sezione coronale della corteccia cerebrale (regione dorsomediale) 24 ore dopo l'iniezione intraperitoneale di LPS o veicolo (controllo). Le cellule sono state colorate con anticorpo anti-Iba1 come precedentemente descritto. Il trattamento pro-infiammatorio con LPS ha determinato cambiamenti nella morfologia della microglia, tra cui ispessimento prossimale e aumento di brevi ramificazioni secondarie dei processi cellulari, con conseguente aspetto "denso". Scala: 20 µm.
Analisi dosimetrica del tasso di assorbimento specifico (SAR) nel cervello di ratto durante l'esposizione a LTE a 1800 MHz. Un modello eterogeneo di ratto fantasma e antenna ad anello precedentemente descritto62 è stato utilizzato per valutare il SAR locale nel cervello, con una griglia cubica di 0,5 mm3. (a) Vista globale di un modello di ratto in una configurazione di esposizione con un'antenna ad anello sopra la testa e un pad termico metallico (giallo) sotto il corpo. (b) Distribuzione dei valori SAR nel cervello adulto con una risoluzione spaziale di 0,5 mm3. L'area delimitata dal contorno nero nella sezione sagittale corrisponde alla corteccia uditiva primaria dove viene analizzata l'attività microgliale e neuronale. La scala di colori dei valori SAR si applica a tutte le simulazioni numeriche mostrate nella figura.
Microglia iniettata con LPS nella corteccia uditiva del ratto dopo esposizione a LTE o Sham. (a) Vista rappresentativa impilata di microglia colorata con anticorpo anti-Iba1 in sezioni coronali della corteccia uditiva del ratto perfusa con LPS 3-4 ore dopo esposizione a Sham o LTE (esposizione). Barra di scala: 20 µm. (bd) Valutazione morfometrica della microglia 3-4 ore dopo esposizione a LTE (punti vuoti) o LTE (esposti, punti neri). (b, c) Copertura spaziale (b) del marcatore della microglia Iba1 e aree di corpi cellulari positivi per Iba1 (c). I dati rappresentano l'area di colorazione anti-Iba1 normalizzata alla media degli animali esposti a Sham. (d) Conteggio dei corpi cellulari microgliali colorati con anti-Iba1. Le differenze tra gli animali Sham (n = 5) e LTE (n = 6) non erano significative (p > 0,05, test t non accoppiato). La parte superiore e inferiore della Nel riquadro, le linee superiore e inferiore rappresentano rispettivamente il 25°-75° percentile e il 5°-95° ​​percentile. Il valore medio è indicato in rosso all'interno del riquadro.
La Tabella 1 riassume il numero di animali e le registrazioni multi-unità ottenute nella corteccia uditiva primaria di quattro gruppi di ratti (Sham, Exposed, Sham-LPS, Exposed-LPS). Nei risultati seguenti, includiamo tutte le registrazioni che mostrano un campo recettivo temporale spettrale (STRF) significativo, ovvero risposte evocate da toni almeno 6 deviazioni standard superiori alle frequenze di scarica spontanee (vedi Tabella 1). Applicando questo criterio, abbiamo selezionato 266 registrazioni per il gruppo Sham, 273 registrazioni per il gruppo Exposed, 299 registrazioni per il gruppo Sham-LPS e 295 registrazioni per il gruppo Exposed-LPS.
Nei paragrafi seguenti, descriveremo innanzitutto i parametri estratti dal campo recettivo spettrale-temporale (ovvero la risposta ai toni puri) e la risposta alle vocalizzazioni specifiche xenogeniche. Descriveremo poi la quantificazione dell'area di risposta in frequenza ottenuta per ciascun gruppo. Considerando la presenza di "dati annidati"30 nel nostro disegno sperimentale, tutte le analisi statistiche sono state eseguite sulla base del numero di posizioni nell'array di elettrodi (ultima riga nella Tabella 1), ma tutti gli effetti descritti di seguito sono stati anche basati sul numero di posizioni in ciascun gruppo. Numero totale di registrazioni multiunitarie raccolte (terza riga nella Tabella 1).
La Figura 4a mostra la distribuzione di frequenza ottimale (BF, che elicita la risposta massima a 75 dB SPL) dei neuroni corticali ottenuta negli animali Sham trattati con LPS e negli animali esposti. L'intervallo di frequenza di BF in entrambi i gruppi è stato esteso da 1 kHz a 36 kHz. L'analisi statistica ha mostrato che queste distribuzioni erano simili (chi-quadro, p = 0,278), suggerendo che i confronti tra i due gruppi potevano essere effettuati senza distorsioni di campionamento.
Effetti dell'esposizione a LTE sui parametri quantificati delle risposte corticali in animali trattati con LPS. (a) Distribuzione del BF nei neuroni corticali di animali trattati con LPS esposti a LTE (nero) e a LTE simulato (bianco). Non vi è alcuna differenza tra le due distribuzioni. (bf) L'effetto dell'esposizione a LTE sui parametri che quantificano il campo recettivo temporale spettrale (STRF). La forza della risposta è stata significativamente ridotta (*p < 0,05, test t non accoppiato) sia per STRF (forza totale della risposta) che per frequenze ottimali (b,c). Durata della risposta, larghezza di banda della risposta e costante di larghezza di banda (df). Sia la forza che l'affidabilità temporale delle risposte alle vocalizzazioni sono state ridotte (g, h). L'attività spontanea non è stata significativamente ridotta (i). (*p < 0,05, test t non accoppiato). (j,k) Effetti dell'esposizione a LTE sulle soglie corticali. Le soglie medie erano significativamente più alte nei ratti esposti a LTE rispetto a ratti esposti a un placebo. Questo effetto è più pronunciato alle basse e medie frequenze.
Le figure 4b-f mostrano la distribuzione dei parametri derivati ​​dall'STRF per questi animali (medie indicate dalle linee rosse). Gli effetti dell'esposizione a LTE sugli animali trattati con LPS sembrano indicare una ridotta eccitabilità neuronale. In primo luogo, l'intensità della risposta complessiva e le risposte erano significativamente inferiori in BF rispetto agli animali Sham-LPS (Fig. 4b,c test t non accoppiato, p = 0,0017; e p = 0,0445). Allo stesso modo, le risposte ai suoni di comunicazione sono diminuite sia nella forza della risposta che nell'affidabilità inter-prova (Fig. 4g,h; test t non accoppiato, p = 0,043). L'attività spontanea era ridotta, ma questo effetto non era significativo (Fig. 4i; p = 0,0745). La durata della risposta, la larghezza di banda di sintonizzazione e la latenza della risposta non sono state influenzate dall'esposizione a LTE negli animali trattati con LPS (Fig. 4d-f), indicando che la selettività di frequenza e la precisione delle risposte di inizio non sono state influenzate dall'esposizione a LTE in Animali trattati con LPS.
Abbiamo quindi valutato se le soglie corticali dei toni puri fossero alterate dall'esposizione a LTE. Dall'area di risposta in frequenza (FRA) ottenuta da ciascuna registrazione, abbiamo determinato le soglie uditive per ciascuna frequenza e ne abbiamo calcolato la media per entrambi i gruppi di animali. La Figura 4j mostra le soglie medie (± errore standard) da 1,1 a 36 kHz nei ratti trattati con LPS. Il confronto delle soglie uditive dei gruppi Sham ed Esposti ha mostrato un aumento sostanziale delle soglie negli animali esposti rispetto agli animali Sham (Fig. 4j), un effetto più pronunciato alle basse e medie frequenze. Più precisamente, alle basse frequenze (< 2,25 kHz), la proporzione di neuroni A1 con soglia alta è aumentata, mentre la proporzione di neuroni con soglia bassa e media è diminuita (chi-quadro = 43,85; p < 0,0001; Fig. 4k, figura a sinistra). Lo stesso effetto è stato osservato a media frequenza (2,25 < Freq(kHz) < 11): una proporzione maggiore di registrazioni corticali con soglie intermedie e una proporzione minore di neuroni con soglie basse rispetto al gruppo non esposto (Chi-quadrato = 71,17; p < 0,001; Figura 4k, pannello centrale). C'era anche una differenza significativa nella soglia per i neuroni ad alta frequenza (≥ 11 kHz, p = 0,0059); la proporzione di neuroni a bassa soglia è diminuita e la proporzione di neuroni a soglia medio-alta è aumentata (chi-quadrato = 10,853; p = 0,04 Figura 4k, pannello di destra).
La Figura 5a mostra la distribuzione di frequenza ottimale (BF, che elicita la massima risposta a 75 dB SPL) dei neuroni corticali ottenuta in animali sani per i gruppi Sham ed Exposed. L'analisi statistica ha mostrato che le due distribuzioni erano simili (chi-quadro, p = 0,157), suggerendo che i confronti tra i due gruppi potevano essere effettuati senza distorsioni di campionamento.
Effetti dell'esposizione a LTE sui parametri quantificati delle risposte corticali in animali sani. (a) Distribuzione del BF nei neuroni corticali di animali sani esposti a LTE (blu scuro) e sottoposti a finta esposizione a LTE (blu chiaro). Non vi è alcuna differenza tra le due distribuzioni. (bf) Effetto dell'esposizione a LTE sui parametri che quantificano il campo recettivo temporale spettrale (STRF). Non vi è stata alcuna variazione significativa nell'intensità della risposta attraverso lo STRF e le frequenze ottimali (b,c). Vi è un leggero aumento nella durata della risposta (d), ma nessuna variazione nella larghezza di banda della risposta e nella larghezza di banda (e, f). Né la forza né l'affidabilità temporale delle risposte alle vocalizzazioni sono cambiate (g, h). Non vi è stata alcuna variazione significativa nell'attività spontanea (i). (*p < 0,05 test t non accoppiato). (j,k) Effetti dell'esposizione a LTE sulle soglie corticali. In media, le soglie non sono state significativamente modificate nei ratti esposti a LTE rispetto ai ratti sottoposti a finta esposizione, ma le soglie di frequenza più elevate erano leggermente inferiori negli animali esposti.
Le figure 5b-f mostrano boxplot che rappresentano la distribuzione e la media (linea rossa) dei parametri derivati ​​dai due set di STRF. Negli animali sani, l'esposizione a LTE ha avuto scarso effetto sul valore medio dei parametri STRF. Rispetto al gruppo Sham (box blu chiaro vs blu scuro per il gruppo esposto), l'esposizione a LTE non ha alterato né l'intensità totale della risposta né la risposta di BF (Fig. 5b,c; test t non accoppiato, p = 0,2176 e p = 0,8696 rispettivamente). Non c'è stato alcun effetto sulla larghezza di banda spettrale e sulla latenza (p = 0,6764 e p = 0,7129, rispettivamente), ma c'è stato un aumento significativo della durata della risposta (p = 0,047). Non c'è stato alcun effetto sulla forza delle risposte di vocalizzazione (Fig. 5g, p = 0,4375), sull'affidabilità inter-prova di queste risposte (Fig. 5h, p = 0,3412) e sull'attività spontanea (Fig. 5).5i; p = 0,3256).
La Figura 5j mostra le soglie medie (± errore standard) da 1,1 a 36 kHz in ratti sani. Non ha mostrato una differenza significativa tra ratti sham ed esposti, ad eccezione di una soglia leggermente inferiore negli animali esposti alle alte frequenze (11–36 kHz) (test t non accoppiato, p = 0,0083). Questo effetto riflette il fatto che negli animali esposti, in questo intervallo di frequenza (chi-quadro = 18,312, p = 0,001; Fig. 5k), c'erano leggermente più neuroni con soglie basse e medie (mentre con soglie alte c'erano meno neuroni).
In conclusione, quando animali sani sono stati esposti a LTE, non si è verificato alcun effetto sulla forza di risposta a toni puri e suoni complessi come le vocalizzazioni. Inoltre, negli animali sani, le soglie uditive corticali erano simili tra gli animali esposti e quelli del gruppo di controllo, mentre negli animali trattati con LPS, l'esposizione a LTE ha determinato un aumento sostanziale delle soglie corticali, soprattutto nella gamma di frequenze basse e medie.
Il nostro studio ha dimostrato che nei ratti maschi adulti con neuroinfiammazione acuta, l'esposizione a LTE-1800 MHz con un SARACx locale di 0,5 W/kg (vedi Metodi) ha determinato una significativa riduzione dell'intensità delle risposte evocate dal suono nelle registrazioni primarie della comunicazione. Questi cambiamenti nell'attività neuronale si sono verificati senza alcuna apparente modifica nell'estensione del dominio spaziale coperto dai processi microgliali. Questo effetto di LTE sull'intensità delle risposte evocate corticali non è stato osservato nei ratti sani. Considerando la somiglianza nella distribuzione ottimale della frequenza tra le unità di registrazione negli animali esposti a LTE e in quelli esposti a sham, le differenze nella reattività neuronale possono essere attribuite agli effetti biologici dei segnali LTE piuttosto che a un bias di campionamento (Fig. 4a). Inoltre, l'assenza di cambiamenti nella latenza di risposta e nella larghezza di banda di sintonizzazione spettrale nei ratti esposti a LTE suggerisce che, molto probabilmente, queste registrazioni sono state campionate dagli stessi strati corticali, che si trovano nella corteccia uditiva primaria piuttosto che nelle regioni secondarie.
A nostra conoscenza, l'effetto della segnalazione LTE sulle risposte neuronali non è stato precedentemente riportato. Tuttavia, studi precedenti hanno documentato la capacità del GSM a 1800 MHz o dell'onda continua (CW) a 1800 MHz di alterare l'eccitabilità neuronale, sebbene con differenze significative a seconda dell'approccio sperimentale. Poco dopo l'esposizione a 1800 MHz CW a un livello SAR di 8,2 W/kg, le registrazioni dai gangli delle lumache hanno mostrato soglie ridotte per l'innesco di potenziali d'azione e modulazione neuronale. D'altra parte, l'attività di spiking e bursting in colture neuronali primarie derivate dal cervello di ratto è stata ridotta dall'esposizione a GSM a 1800 MHz o 1800 MHz CW per 15 minuti a un SAR di 4,6 W/kg. Questa inibizione era solo parzialmente reversibile entro 30 minuti di esposizione. Il silenziamento completo dei neuroni è stato ottenuto a un SAR di 9,2 W/kg. L'analisi dose-risposta ha mostrato che il GSM a 1800 MHz era più efficace rispetto a 1800 MHz CW nella soppressione dell'attività a raffiche, suggerendo che le risposte neuronali dipendono dalla modulazione del segnale RF.
Nel nostro contesto, le risposte corticali evocate sono state raccolte in vivo da 3 a 6 ore dopo la fine dell'esposizione di 2 ore solo alla testa. In uno studio precedente, abbiamo indagato l'effetto del GSM-1800 MHz a SARACx di 1,55 W/kg e non abbiamo trovato alcun effetto significativo sulle risposte corticali evocate dal suono in ratti sani. Qui, l'unico effetto significativo evocato in ratti sani dall'esposizione a LTE-1800 a 0,5 W/kg SARACx è stato un leggero aumento della durata della risposta alla presentazione di toni puri. Questo effetto è difficile da spiegare perché non è accompagnato da un aumento dell'intensità della risposta, suggerendo che questa maggiore durata della risposta si verifica con lo stesso numero totale di potenziali d'azione sparati dai neuroni corticali. Una spiegazione potrebbe essere che l'esposizione a LTE può ridurre l'attività di alcuni interneuroni inibitori, poiché è stato documentato che nell'ACx primaria l'inibizione feedforward controlla la durata delle risposte delle cellule piramidali innescate dall'input talamico eccitatorio33,34, 35, 36, 37.
Al contrario, nei ratti sottoposti a neuroinfiammazione indotta da LPS, l'esposizione a LTE non ha avuto alcun effetto sulla durata della scarica neuronale evocata dal suono, ma sono stati rilevati effetti significativi sull'intensità delle risposte evocate. Infatti, rispetto alle risposte neuronali registrate nei ratti esposti a LPS simulato, i neuroni nei ratti trattati con LPS ed esposti a LTE hanno mostrato una riduzione dell'intensità delle loro risposte, un effetto osservato sia con la presentazione di toni puri che di vocalizzazioni naturali. La riduzione dell'intensità della risposta ai toni puri si è verificata senza un restringimento della larghezza di banda di sintonizzazione spettrale di 75 dB e, poiché si è verificata a tutte le intensità sonore, ha determinato un aumento delle soglie acustiche dei neuroni corticali alle basse e medie frequenze.
La riduzione della forza della risposta evocata ha indicato che l'effetto della segnalazione LTE a SARACx di 0,5 W/kg negli animali trattati con LPS era simile a quello del GSM-1800 MHz applicato a un SARACx tre volte superiore (1,55 W/kg) 28. Come per la segnalazione GSM, l'esposizione della testa a LTE-1800 MHz può ridurre l'eccitabilità neuronale nei neuroni ACx del ratto sottoposti a neuroinfiammazione innescata da LPS. In linea con questa ipotesi, abbiamo anche osservato una tendenza verso una ridotta affidabilità delle prove delle risposte neuronali alla vocalizzazione (Fig. 4h) e una ridotta attività spontanea (Fig. 4i). Tuttavia, è stato difficile determinare in vivo se la segnalazione LTE riduce l'eccitabilità intrinseca neuronale o riduce l'input sinaptico, controllando così le risposte neuronali in ACx.
In primo luogo, queste risposte più deboli potrebbero essere dovute alla ridotta eccitabilità intrinseca delle cellule corticali dopo l'esposizione a LTE 1800 MHz. A supporto di questa ipotesi, GSM-1800 MHz e 1800 MHz-CW hanno ridotto l'attività di scarica quando applicati direttamente a colture primarie di neuroni corticali di ratto con livelli SAR rispettivamente di 3,2 W/kg e 4,6 W/kg, ma è stato necessario un livello SAR di soglia per ridurre significativamente l'attività di scarica. A sostegno di una ridotta eccitabilità intrinseca, abbiamo anche osservato tassi inferiori di scarica spontanea negli animali esposti rispetto agli animali sottoposti a finta esposizione.
In secondo luogo, l'esposizione a LTE può anche influenzare la trasmissione sinaptica dalle sinapsi talamo-corticali o cortico-corticali. Numerosi studi dimostrano ora che, nella corteccia uditiva, l'ampiezza della sintonizzazione spettrale non è determinata esclusivamente dalle proiezioni talamiche afferenti, ma che le connessioni intracorticali conferiscono un input spettrale aggiuntivo ai siti corticali39,40. Nei nostri esperimenti, il fatto che la STRF corticale mostrasse larghezze di banda simili negli animali esposti e in quelli sottoposti a finta esposizione suggeriva indirettamente che gli effetti dell'esposizione a LTE non riguardavano la connettività cortico-corticale. Ciò suggerisce anche che una maggiore connettività in altre regioni corticali esposte a SAR rispetto a quella misurata in ACx (Fig. 2) potrebbe non essere responsabile delle risposte alterate qui riportate.
In questo caso, una maggiore proporzione di registrazioni corticali esposte a LPS ha mostrato soglie elevate rispetto agli animali esposti a LPS simulato. Dato che è stato proposto che la soglia acustica corticale sia controllata principalmente dalla forza della sinapsi talamo-corticale39,40, si può sospettare che la trasmissione talamo-corticale sia parzialmente ridotta dall'esposizione, sia a livello presinaptico (riduzione del rilascio di glutammato) sia a livello postsinaptico (riduzione del numero o dell'affinità dei recettori).
Analogamente agli effetti del GSM-1800 MHz, le risposte neuronali alterate indotte dall'LTE si sono verificate nel contesto della neuroinfiammazione innescata da LPS, caratterizzata da risposte microgliali. Le evidenze attuali suggeriscono che la microglia influenza fortemente l'attività delle reti neuronali nei cervelli normali e patologici41,42,43. La loro capacità di modulare la neurotrasmissione dipende non solo dalla produzione di composti che producono, che possono limitare o meno la neurotrasmissione, ma anche dall'elevata motilità dei loro processi cellulari. Nella corteccia cerebrale, sia l'aumento che la diminuzione dell'attività delle reti neuronali innescano una rapida espansione del dominio spaziale microgliale a causa della crescita dei processi microgliali44,45. In particolare, le protrusioni microgliali vengono reclutate vicino alle sinapsi talamocorticali attivate e possono inibire l'attività delle sinapsi eccitatorie attraverso meccanismi che coinvolgono la produzione locale di adenosina mediata dalla microglia.
Nei ratti trattati con LPS e sottoposti a GSM-1800 MHz con SARACx a 1,55 W/kg, si è osservata una diminuzione dell'attività dei neuroni ACx con la crescita dei processi microgliali, evidenziata da significative aree colorate con Iba1 nell'ACx28. Questa osservazione suggerisce che il rimodellamento microgliale innescato dall'esposizione al GSM può contribuire attivamente alla riduzione delle risposte neuronali evocate dal suono indotta dal GSM. Il nostro studio attuale contraddice questa ipotesi nel contesto dell'esposizione della testa a LTE con SARACx limitato a 0,5 W/kg, poiché non abbiamo riscontrato alcun aumento del dominio spaziale coperto dai processi microgliali. Tuttavia, ciò non esclude alcun effetto della segnalazione LTE sulla microglia attivata da LPS, che a sua volta potrebbe influenzare l'attività neuronale. Sono necessari ulteriori studi per rispondere a questa domanda e per determinare i meccanismi attraverso i quali la neuroinfiammazione acuta altera le risposte neuronali alla segnalazione LTE.
A nostra conoscenza, l'effetto dei segnali LTE sull'elaborazione uditiva non è stato studiato prima. I nostri studi precedenti 26,28 e lo studio attuale hanno dimostrato che, in presenza di infiammazione acuta, l'esposizione della sola testa a GSM-1800 MHz o LTE-1800 MHz ha provocato alterazioni funzionali nelle risposte neuronali nell'ACx, come dimostrato dall'aumento della soglia uditiva. Per almeno due motivi principali, la funzione cocleare non dovrebbe essere influenzata dalla nostra esposizione a LTE. In primo luogo, come mostrato nello studio dosimetrico riportato nella Figura 2, i livelli più elevati di SAR (vicini a 1 W/kg) si trovano nella corteccia dorsomediale (sotto l'antenna) e diminuiscono sostanzialmente spostandosi lateralmente. La parte ventrale della testa. Si può stimare che sia circa 0,1 W/kg a livello del padiglione auricolare del ratto (sotto il canale uditivo). In secondo luogo, quando le orecchie di cavia sono state esposte per 2 mesi a GSM 900 MHz (5 giorni/settimana, 1 ora/giorno, SAR tra 1 e 4 W/kg), non sono state rilevate modifiche nell'entità del prodotto di distorsione Soglie otoacustiche per l'emissione e risposte uditive del tronco encefalico 47. Inoltre, l'esposizione ripetuta della testa a GSM 900 o 1800 MHz a un SAR locale di 2 W/kg non ha influenzato la funzione delle cellule ciliate esterne della coclea nei ratti sani48,49. Questi risultati fanno eco ai dati ottenuti negli esseri umani, dove le indagini hanno dimostrato che l'esposizione da 10 a 30 minuti ai campi elettromagnetici dei telefoni cellulari GSM non ha un effetto coerente sull'elaborazione uditiva valutata a livello cocleare50,51,52 o del tronco encefalico53,54.
Nel nostro studio, sono state osservate in vivo variazioni dell'attività neuronale indotte da LTE da 3 a 6 ore dopo la fine dell'esposizione. In uno studio precedente sulla parte dorsomediale della corteccia, diversi effetti indotti da GSM-1800 MHz osservati 24 ore dopo l'esposizione non erano più rilevabili 72 ore dopo l'esposizione. Questo è il caso dell'espansione dei processi microgliali, della downregulation del gene IL-1ß e della modificazione post-traduzionale dei recettori AMPA. Considerando che la corteccia uditiva ha un valore SAR inferiore (0,5 W/kg) rispetto alla regione dorsomediale (2,94 W/kg26), le variazioni dell'attività neuronale qui riportate sembrano essere transitorie.
I nostri dati dovrebbero tenere conto dei limiti SAR di qualificazione e delle stime dei valori SAR effettivi raggiunti nella corteccia cerebrale degli utenti di telefoni cellulari. Gli standard attualmente utilizzati per la protezione del pubblico fissano il limite SAR a 2 W/kg per l'esposizione localizzata della testa o del tronco alle radiofrequenze nella gamma RF di 100 kHz e 6 GHz.
Sono state eseguite simulazioni di dose utilizzando diversi modelli di testa umana per determinare l'assorbimento di potenza RF in diversi tessuti della testa durante la comunicazione generale con la testa o con il telefono cellulare. Oltre alla diversità dei modelli di testa umana, queste simulazioni evidenziano differenze o incertezze significative nella stima dell'energia assorbita dal cervello in base a parametri anatomici o istologici come la forma esterna o interna del cranio, lo spessore o il contenuto di acqua. I diversi tessuti della testa variano ampiamente in base all'età, al sesso o all'individuo 56,57,58. Inoltre, le caratteristiche del telefono cellulare, come la posizione interna dell'antenna e la posizione del telefono cellulare rispetto alla testa dell'utente, influenzano fortemente il livello e la distribuzione dei valori SAR nella corteccia cerebrale59,60. Tuttavia, considerando le distribuzioni SAR riportate nella corteccia cerebrale umana, che sono state stabilite da modelli di telefono cellulare che emettono radiofrequenze nella gamma 1800 MHz58, 59, 60, sembra che i livelli SAR raggiunti nella corteccia uditiva umana siano ancora inferiori alla metà di quelli della corteccia cerebrale umana corteccia.Il nostro studio (SARACx 0,5 W/kg).Pertanto, i nostri dati non mettono in discussione gli attuali limiti dei valori SAR applicabili al pubblico.
In conclusione, il nostro studio dimostra che una singola esposizione della sola testa a LTE-1800 MHz interferisce con le risposte neuronali dei neuroni corticali agli stimoli sensoriali. In linea con le precedenti caratterizzazioni degli effetti della segnalazione GSM, i nostri risultati suggeriscono che gli effetti della segnalazione LTE sull'attività neuronale variano in base allo stato di salute. La neuroinfiammazione acuta sensibilizza i neuroni a LTE-1800 MHz, determinando un'alterazione dell'elaborazione corticale degli stimoli uditivi.
I dati sono stati raccolti a 55 giorni di età dalla corteccia cerebrale di 31 ratti Wistar maschi adulti ottenuti nel laboratorio Janvier. I ratti sono stati alloggiati in una struttura a umidità controllata (50-55%) e temperatura (22-24 °C) con un ciclo luce/buio di 12 ore/12 ore (luci accese alle 7:30) con libero accesso a cibo e acqua. Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con le linee guida stabilite dalla Direttiva del Consiglio delle Comunità Europee (2010/63/UE del Consiglio), che sono simili a quelle descritte nelle Linee guida della Society for Neuroscience sull'uso degli animali nella ricerca neuroscientifica. Questo protocollo è stato approvato dal Comitato Etico Paris-Sud e Centro (CEEA n. 59, Progetto 2014-25, Protocollo Nazionale 03729.02) utilizzando procedure validate da questo comitato 32-2011 e 34-2012.
Gli animali sono stati abituati alle camere di allevamento per almeno una settimana prima del trattamento con LPS e dell'esposizione (o della finta esposizione) a campi elettromagnetici a bassa energia (LTE-EMF).
Ventidue ratti sono stati iniettati per via intraperitoneale (ip) con LPS di E. coli (250 µg/kg, sierotipo 0127:B8, SIGMA) diluito con soluzione fisiologica isotonica sterile priva di endotossine 24 ore prima dell'esposizione a LTE o a una finta esposizione (n per gruppo). = 11). Nei ratti maschi Wistar di 2 mesi, questo trattamento con LPS produce una risposta neuroinfiammatoria che è marcata nella corteccia cerebrale da diversi geni proinfiammatori (fattore di necrosi tumorale alfa, interleuchina 1ß, CCL2, NOX2, NOS2) sono stati sovraregolati 24 ore dopo l'iniezione di LPS, incluso un aumento di 4 e 12 volte nei livelli di trascritti che codificano rispettivamente l'enzima NOX2 e l'interleuchina 1ß. A questo punto temporale di 24 ore, la microglia corticale ha mostrato la tipica morfologia cellulare "densa" prevista dall'attivazione proinfiammatoria delle cellule innescata da LPS (Figura 1), che è in contrasto con l'attivazione innescata da LPS da parte di altri. L'attivazione proinfiammatoria cellulare corrisponde a 24, 61.
L'esposizione della sola testa al campo elettromagnetico LTE è stata effettuata utilizzando la configurazione sperimentale precedentemente utilizzata per valutare l'effetto del campo elettromagnetico GSM26. L'esposizione a LTE è stata effettuata 24 ore dopo l'iniezione di LPS (11 animali) o nessun trattamento con LPS (5 animali). Gli animali sono stati leggermente anestetizzati con ketamina/xilazina (ketamina 80 mg/kg, ip; xilazina 10 mg/kg, ip) prima dell'esposizione per prevenire movimenti e per garantire che la testa dell'animale fosse nell'antenna ad anello che emetteva il segnale LTE. Posizione riproducibile di seguito. Metà dei ratti della stessa gabbia sono serviti da controlli (11 animali esposti fittizi, su 22 ratti pretrattati con LPS): sono stati posti sotto l'antenna ad anello e l'energia del segnale LTE è stata impostata a zero. I pesi degli animali esposti e di quelli esposti fittizi erano simili (p = 0,558, test t non accoppiato, ns). Tutti gli animali anestetizzati sono stati posti su un tappetino riscaldante senza metallo per mantenere la loro temperatura corporea intorno a 37 °C per tutta la durata dell'esperimento. Come negli esperimenti precedenti, il tempo di esposizione è stato impostato a 2 ore. Dopo l'esposizione, posizionare l'animale su un altro tappetino riscaldante in sala operatoria. La stessa procedura di esposizione è stata applicata a 10 ratti sani (non trattati con LPS), metà dei quali sono stati sottoposti a finta esposizione dalla stessa gabbia (p = 0,694).
Il sistema di esposizione era simile ai sistemi 25, 62 descritti in studi precedenti, con il generatore di radiofrequenza sostituito per generare campi elettromagnetici LTE invece che GSM. In breve, un generatore RF (SMBV100A, 3,2 GHz, Rohde & Schwarz, Germania) che emetteva un campo elettromagnetico LTE - 1800 MHz era collegato a un amplificatore di potenza (ZHL-4W-422+, Mini-Circuits, USA), un circolatore (D3 1719-N, Sodhy, Francia), un accoppiatore a due vie (CD D 1824-2, − 30 dB, Sodhy, Francia) e un divisore di potenza a quattro vie (DC D 0922-4N, Sodhy, Francia), consentendo l'esposizione simultanea di quattro animali. Un misuratore di potenza (N1921A, Agilent, USA) collegato a un accoppiatore bidirezionale consentiva la misurazione e il monitoraggio continui della potenza incidente e riflessa all'interno del dispositivo. Ciascuna uscita era collegata a un'antenna ad anello. (Sama-Sistemi srl; Roma), consentendo l'esposizione parziale della testa dell'animale. L'antenna ad anello è costituita da un circuito stampato con due linee metalliche (costante dielettrica εr = 4,6) incise su un substrato epossidico isolante. A un'estremità, il dispositivo è costituito da un filo largo 1 mm che forma un anello posizionato vicino alla testa dell'animale. Come in studi precedenti26,62, il tasso di assorbimento specifico (SAR) è stato determinato numericamente utilizzando un modello numerico di ratto e un metodo FDTD (finite difference time domain)63,64,65. Sono stati determinati anche sperimentalmente in un modello omogeneo di ratto utilizzando sonde Luxtron per misurare l'aumento di temperatura. In questo caso, il SAR in W/kg è calcolato utilizzando la formula: SAR = C ΔT/Δt, dove C è la capacità termica in J/(kg K), ΔT, in °K e Δt Variazione di temperatura, tempo in secondi. I valori SAR determinati numericamente sono stati confrontati con i valori SAR sperimentali ottenuti utilizzando un modello omogeneo, soprattutto in regioni equivalenti del cervello del ratto. La differenza tra le misurazioni numeriche del SAR e i valori SAR rilevati sperimentalmente è inferiore al 30%.
La Figura 2a mostra la distribuzione del SAR nel cervello del ratto nel modello di ratto, che corrisponde alla distribuzione in termini di peso corporeo e dimensioni dei ratti utilizzati nel nostro studio. Il SAR medio del cervello era di 0,37 ± 0,23 W/kg (media ± DS). I valori di SAR sono più alti nell'area corticale appena sotto l'antenna ad anello. Il SAR locale in ACx (SARACx) era di 0,50 ± 0,08 W/kg (media ± DS) (Fig. 2b). Poiché i pesi corporei dei ratti esposti sono omogenei e le differenze nello spessore del tessuto della testa sono trascurabili, ci si aspetta che il SAR effettivo di ACx o di altre aree corticali sia molto simile tra un animale esposto e un altro.
Al termine dell'esposizione, agli animali sono state somministrate dosi aggiuntive di ketamina (20 mg/kg, ip) e xilazina (4 mg/kg, ip) fino a quando non sono stati osservati movimenti riflessi dopo la stimolazione della zampa posteriore. Un anestetico locale (Xylocaina 2%) è stato iniettato per via sottocutanea nella cute e nel muscolo temporale sopra il cranio e gli animali sono stati posizionati su un sistema di riscaldamento privo di metallo. Dopo aver posizionato l'animale nel telaio stereotassico, è stata eseguita una craniotomia sulla corteccia temporale sinistra. Come nel nostro precedente studio66, partendo dalla giunzione delle ossa parietali e temporali, l'apertura era larga 9 mm e alta 5 mm. La dura madre sopra l'ACx è stata rimossa con cura sotto controllo binoculare senza danneggiare i vasi sanguigni. Al termine della procedura, è stata costruita una base in cemento acrilico dentale per il fissaggio atraumatico della testa dell'animale durante la registrazione. Posizionare il telaio stereotassico con l'animale in una camera di attenuazione acustica (IAC, modello AC1).
I dati sono stati ottenuti da registrazioni multi-unità nella corteccia uditiva primaria di 20 ratti, inclusi 10 animali pretrattati con LPS. Le registrazioni extracellulari sono state ottenute da un array di 16 elettrodi di tungsteno (TDT, ø: 33 µm, < 1 MΩ) costituito da due file di 8 elettrodi distanziati di 1000 µm (350 µm tra gli elettrodi nella stessa fila). Un filo d'argento (ø: 300 µm) per la messa a terra è stato inserito tra l'osso temporale e la dura madre controlaterale. La posizione stimata della corteccia uditiva primaria è 4-7 mm posteriormente al bregma e 3 mm ventralmente alla sutura sopratemporale. Il segnale grezzo è stato amplificato 10.000 volte (TDT Medusa) e quindi elaborato da un sistema di acquisizione dati multicanale (RX5, TDT). I segnali raccolti da ciascun elettrodo sono stati filtrati (610–10.000 Hz) per estrarre Attività multi-unitaria (MUA). I ​​livelli di trigger sono stati impostati con cura per ciascun elettrodo (da coautori in cieco rispetto allo stato di esposizione o di finta esposizione) per selezionare il potenziale d'azione più grande dal segnale. L'ispezione online e offline delle forme d'onda ha mostrato che la MUA raccolta consisteva in potenziali d'azione generati da 3 a 6 neuroni vicino agli elettrodi. All'inizio di ogni esperimento, abbiamo impostato la posizione dell'array di elettrodi in modo che due file di otto elettrodi potessero campionare i neuroni, dalle risposte a bassa frequenza a quelle ad alta frequenza quando eseguite nell'orientamento rostrale.
Gli stimoli acustici sono stati generati in Matlab, trasmessi a un sistema di diffusione sonora basato su RP2.1 (TDT) e inviati a un altoparlante Fostex (FE87E). L'altoparlante è stato posizionato a 2 cm dall'orecchio destro del ratto, distanza alla quale l'altoparlante produceva uno spettro di frequenza piatto (± 3 dB) tra 140 Hz e 36 kHz. La calibrazione dell'altoparlante è stata eseguita utilizzando rumore e toni puri registrati con un microfono Bruel and Kjaer 4133 accoppiato a un preamplificatore B&K 2169 e a un registratore digitale Marantz PMD671. Il campo recettivo temporale spettrale (STRF) è stato determinato utilizzando 97 frequenze gamma-tone, che coprono 8 ottave (0,14–36 kHz), presentate in ordine casuale a 75 dB SPL a 4,15 Hz. L'area di risposta in frequenza (FRA) è determinata utilizzando lo stesso set di toni e presentata in ordine casuale a 2 Hz da 75 a 5 dB SPL. Ogni frequenza viene presentato otto volte per ciascuna intensità.
Sono state valutate anche le risposte a stimoli naturali. In studi precedenti, abbiamo osservato che le vocalizzazioni dei ratti raramente elicitavano forti risposte nell'ACx, indipendentemente dalla frequenza ottimale neuronale (BF), mentre quelle specifiche degli xenotrapianti (ad esempio, vocalizzazioni di uccelli canori o cavie) in genere attivavano l'intera mappa tonale. Pertanto, abbiamo testato le risposte corticali alle vocalizzazioni nelle cavie (il fischietto utilizzato in 36 era collegato a 1 s di stimoli, presentati 25 volte).

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